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<title>Espressione eterologa</title>
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<div id="wx_article">
<wx:section level="1" title="Espressione eterologa" id="wxsec1"><h1 class="pagetitle" id="wx1">Espressione eterologa</h1>

<p id="wx2">L'<b id="wx3">espressione eterologa</b> è un processo che permette l'espressione di proteine specifiche in un organismo che normalmente non le produrrebbe. Si tratta di una branca dell'ingegneria genetica nota come <a href="/wit/Genetica_applicata" class="new" title="Genetica applicata" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Genetica_applicata" id="wx4">genetica applicata</a>.</p>

<p id="wx5"><br id="wx6"/>
Tale processo necessita di due cose:</p>

<ul id="wx7">
<li id="wx8">
<p id="wx9">il <a href="/wit/Gene" title="Gene" wx:linktype="known" wx:pagename="Gene" wx:page_id="1723644" id="wx10">gene</a> di interesse</p>
</li>

<li id="wx11">
<p id="wx12">il sistema di espressione</p>
</li>
</ul>

<p id="wx13"><br id="wx14"/>
</p>

<div id="wx_toc"/>

<a id="Come_trovare_il_gene_di_interesse" name="Come_trovare_il_gene_di_interesse"/>
<wx:section level="2" title="Come trovare il gene di interesse" id="wxsec2"><h2 id="wx15">Come trovare il gene di interesse</h2>

<p id="wx16">Innanzitutto dobbiamo avere a disposizione delle <a href="/wit/Genoteche" class="new" title="Genoteche" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Genoteche" id="wx17">genoteche</a>, ovvero banche dati genetiche di vettori contenenti gli inserti genetici rappresentativi di tutto il <a href="/wit/Genoma" title="Genoma" wx:linktype="known" wx:pagename="Genoma" wx:page_id="100139" id="wx18">genoma</a> di un organismo. Tali vettori (BAC, YAC, bacmidi, cosmidi…) sono inseriti a loro volta all’interno di microrganismi per poter essere conservati e replicati. La genoteca può essere definita come tale solo se può permetterci di identificare il gene di interesse e se ci permette di isolare il vettore che lo contiene.</p>

<p id="wx19"><br id="wx20"/>
Per trovare il gene di interesse dobbiamo essere a conoscenza almeno di uno di queste informazioni:</p>

<ul id="wx21">
<li id="wx22">
<p id="wx23">Sequenza del gene</p>
</li>

<li id="wx24">
<p id="wx25">Sequenza amminoacidica tradotta dal gene</p>
</li>

<li id="wx26">
<p id="wx27">Funzione biochimica della proteina codificata</p>
</li>
</ul>

<p id="wx28"><br id="wx29"/>
In base al tipo di informazione disponibile ci sono diversi metodi di identificazione.</p>

<p id="wx30"><br id="wx31"/>
</p>

<a id="Disponibilit.C3.A0_della_sequenza_genetica" name="Disponibilit.C3.A0_della_sequenza_genetica"/>
<wx:section level="3" title="Disponibilità della sequenza genetica" id="wxsec9"><h3 id="wx32">Disponibilità della sequenza genetica</h3>

<p id="wx33">Con tale informazione possiamo creare dei <a href="/wit/Primer" title="Primer" wx:linktype="known" wx:pagename="Primer" wx:page_id="107158" id="wx34">primer</a> complementari al gene di interesse in modo che vi si possano legare. In sostanza si tratta di trasferire la genoteca su un filtro di nitrocellulosa con la tecnica della replica plating, lisare le cellule e denaturare il DNA. A questo punto si espone il filtro al primer marcato (magari contenenti un fluoroforo) permettendo l’annealing in modo da capire in quale delle colonie della genoteca è presente il vettore contenente il gene di nostro interesse.</p>

<a id="Disponibilit.C3.A0_della_sequenza_amminoacidica" name="Disponibilit.C3.A0_della_sequenza_amminoacidica"/>
</wx:section><wx:section level="3" title="Disponibilità della sequenza amminoacidica" id="wxsec10"><h3 id="wx35">Disponibilità della sequenza amminoacidica</h3>

<p id="wx36">Da tale sequenza modo possiamo risalire alla sequenza delle basi che hanno codificato per il polipeptide, ma essendo che il codice genetico è degenerato (ovvero un’amminoacido è codificato da più triplette) potremmo ottenere un pool molto esteso di possibili primer tutti quanti da testare proseguendo poi come con il metodo precedente.</p>

<p id="wx37">In alternativa è possibile creare degli <a href="/wit/Anticorpi" title="Anticorpi" wx:linktype="known" wx:pagename="Anticorpi" wx:page_id="269545" id="wx38">anticorpi</a> specifici (Ab) in grado di legare una specifica sequenza amminoacidica del polipeptide codificato. Funziona così: l’Ab1 modificato lega il peptide, esponiamo la colonia ad un Ab2 (a cui è legato l’enzima 2-galattosidasi) in grado di riconoscere Ab1. Se nel terreno in cui crescono le colonie è presente X-gal (colorante) questo viene catalizzato e assume una colorazione blu che possiamo riscontrare ad occhio nudo. In questo caso è necessaria l’espressione del vettore.</p>

<a id="Disponibilit.C3.A0_della_funzione_biochimica" name="Disponibilit.C3.A0_della_funzione_biochimica"/>
</wx:section><wx:section level="3" title="Disponibilità della funzione biochimica" id="wxsec11"><h3 id="wx39">Disponibilità della funzione biochimica</h3>

<p id="wx40">Disponendo di questa informazione si agisce per complementazione del fenotipo mutato, ovvero in questo modo: vogliamo capire in quale vettore della nostra genoteca è presente il gene che codifica per la proteina A. Prendiamo dei ceppi batterici mutanti A- e TRP-. Trasformiamo tali ceppi con i vettori presenti nella genoteca (contenenti tutti il selectable marker TRP+ ). Infine poniamo i ceppi su terreno non contenente A e lasciamo crescere. Ne otteniamo il seguente risultato:</p>

<ul id="wx41">
<li id="wx42">
<p id="wx43">le cellule che non hanno ricevuto il vettore non sono in grado di crescere perché non sono in grado di produrre né TRP né A.</p>
</li>

<li id="wx44">
<p id="wx45">le cellule che hanno ricevuto il plasmide invece producono tutte TRP, ma possono crescere solo quelle che producono anche A (perché nel terreno non è disponibile).</p>
</li>
</ul>

<p id="wx46">In questo modo possiamo selezionare le cellule contenenti il vettore con il gene per A.</p>

<a id="Microrganismi_modello" name="Microrganismi_modello"/>
</wx:section></wx:section><wx:section level="2" title="Microrganismi modello" id="wxsec3"><h2 id="wx47">Microrganismi modello</h2>

<p id="wx48">I microrganismi più utilizzati in genetica sono:</p>

<ul id="wx49">
<li id="wx50"><a href="/wit/Escherichia_coli" title="Escherichia coli" wx:linktype="known" wx:pagename="Escherichia_coli" wx:page_id="300593" id="wx51">Escherichia coli</a>
<p id="wx52">,</p>
</li>

<li id="wx53"><a href="/wit/Bacillus_subtilis" class="new" title="Bacillus subtilis" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Bacillus_subtilis" id="wx54">Bacillus subtilis</a>
<p id="wx55">,</p>
</li>

<li id="wx56"><a href="/wit/Kluyveromices_lactis" class="new" title="Kluyveromices lactis" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Kluyveromices_lactis" id="wx57">Kluyveromices lactis</a>
<p id="wx58">,</p>
</li>

<li id="wx59"><a href="/wit/Pichia_pastoris" class="new" title="Pichia pastoris" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Pichia_pastoris" id="wx60">Pichia pastoris</a>
<p id="wx61">,</p>
</li>

<li id="wx62"><a href="/wit/S.cerevisiae" class="new" title="S.cerevisiae" wx:linktype="unknown" wx:pagename="S.cerevisiae" id="wx63">S.cerevisiae</a>
<p id="wx64">.</p>
</li>
</ul>

<a id="Vettori_di_espressione" name="Vettori_di_espressione"/>
</wx:section><wx:section level="2" title="Vettori di espressione" id="wxsec4"><h2 id="wx65">Vettori di espressione</h2>

<p id="wx66">Il vettore di espressione è il fattore più importante di tutto il meccanismo di produzione e questo perché esso deve contenere tutti i segnali necessari all’organismo ospite per trascrivere il gene, tradurlo in polipeptide, effettuare modificazioni post-traduzionali, secernere la proteina. Tali segnali sono diversi variano in base al sistema di espressione.</p>

<a id="Promotore" name="Promotore"/>
<wx:section level="3" title="Promotore" id="wxsec12"><h3 id="wx67">Promotore</h3>

<p id="wx68">Il promotore è una sequenza che si trova a monte della sequenza codificante riconosciuta in modo molo affine dalla <a href="/wit/RNA_polimerasi" title="RNA polimerasi" wx:linktype="known" wx:pagename="RNA_polimerasi" wx:page_id="1249148" id="wx69">RNA polimerasi</a> II e che permette l’avvio della trascrizione. Un promotore utilizzato per l’espressione di geni eterologhi deve essere:</p>

<ul id="wx70">
<li id="wx71">
<p id="wx72">FORTE: alta affinità con la RNA polimerasi II in modo che una volta avviata l’espressione, il totale delle proteine espresse dalla cellula sia costituita da un 30% di quella di interesse.</p>
</li>

<li id="wx73">
<p id="wx74">REGOLATO: ovvero inducibile o dereprimibile in modo semplice sfruttando sistemi binari ON/OFF simili a quelli batterici.</p>
</li>
</ul>

<p id="wx75">Parlando di promotori più utilizzati troviamo:</p>

<ul id="wx76">
<li id="wx77">
<p id="wx78">Promotore TRP</p>
</li>

<li id="wx79">
<p id="wx80">Promotore LAC</p>
</li>

<li id="wx81">
<p id="wx82">Promotore ARABAD</p>
</li>

<li id="wx83">
<p id="wx84">Promotore CIts</p>
</li>
</ul>

<a id="Terminatore" name="Terminatore"/>
</wx:section><wx:section level="3" title="Terminatore" id="wxsec13"><h3 id="wx85">Terminatore</h3>

<p id="wx86">Il <a href="/wit/Terminatore" title="Terminatore" wx:linktype="known" wx:pagename="Terminatore" wx:page_id="112592" id="wx87">terminatore</a> è una sequenza in grado di indicare alla RNApolII di terminare la trascrizione. La terminazione può avvenire in due modi:</p>

<ul id="wx88">
<li id="wx89">
<p id="wx90">tramite un <a href="/wit/Terminatore_intrinseco" class="new" title="Terminatore intrinseco" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Terminatore_intrinseco" id="wx91">terminatore intrinseco</a></p>
</li>

<li id="wx92">
<p id="wx93">in modo Rho-dipendente</p>
</li>
</ul>

<a id="Traduzione_eterologa" name="Traduzione_eterologa"/>
</wx:section></wx:section><wx:section level="2" title="Traduzione eterologa" id="wxsec5"><h2 id="wx94">Traduzione eterologa</h2>

<p id="wx95">Il sistema di <a href="/wit/Traduzione" title="Traduzione" wx:linktype="known" wx:pagename="Traduzione" wx:page_id="101044" id="wx96">traduzione</a> funziona nello stesso modo nella quasi totalità degli organismi viventi se non che il processo varia i propri segnali dai procarioti agli eucarioti. I segnali necessari sono:</p>

<ul id="wx97">
<li id="wx98">
<p id="wx99">AUG di inizio</p>
</li>

<li id="wx100">
<p id="wx101">RBS (ribosomal binding site)</p>
</li>

<li id="wx102">
<p id="wx103">Codoni di STOP</p>
</li>
</ul>

<p id="wx104">In particolare la RBS è nota come <a href="/wit/Sequenza_di_Shine-Delgarno" class="new" title="Sequenza di Shine-Delgarno" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Sequenza_di_Shine-Delgarno" id="wx105">Sequenza di Shine-Delgarno</a> per i <a href="/wit/Procarioti" title="Procarioti" wx:linktype="known" wx:pagename="Procarioti" wx:page_id="89300" id="wx106">procarioti</a> e <a href="/wit/Sequenza_di_Kozak" title="Sequenza di Kozak" wx:linktype="known" wx:pagename="Sequenza_di_Kozak" wx:page_id="1107536" id="wx107">Sequenza di Kozak</a> per gli <a href="/wit/Eucarioti" title="Eucarioti" wx:linktype="known" wx:pagename="Eucarioti" wx:page_id="68462" id="wx108">eucarioti</a>. Tali sequenze hanno la stessa funzione, ma non sono intercambiabili tra loro, bisogna usare quella necessaria al nostro sistema di espressione per permettere l’attacco dei ribosomi.</p>

<a id="Problemi_di_traduzione" name="Problemi_di_traduzione"/>
<wx:section level="3" title="Problemi di traduzione" id="wxsec14"><h3 id="wx109">Problemi di traduzione</h3>

<p id="wx110">Il processo di traduzione, seppur universale, ha delle eccezioni di cui dobbiamo tenere conto per l’espressione di una proteina in un organismo diverso da quello di partenza per fare in modo che il prodotto finale sia comunque identico a quello desiderato.</p>

<p id="wx111">Uno dei problemi meno comuni, ma di cui bisogna tenere conto, è che alcuni organismi fanno eccezione in alcune codifiche dei codoni di traduzione quandi dobbiamo appurare, prima di esprimere, che il sistema di codifica sia il medesimo in modo da non trovarci con un polipeptide differente da quello atteso. E’ possibile risolvere questo problema creando una nuova versione del gene (tramite mutagenesi sito-specifica se le differenze sono piccole) compatibile con l’ospite.</p>

<p id="wx112"><br id="wx113"/>
Un altro problema riscontrabile deriva dal fatto che alcuni organismi sfruttano preferibilmente certi codoni per codificare un amminoacido piuttosto che altri e di conseguenza esprimendo maggiormente alcuni <a href="/wit/Amminoacil-t-rna" class="new" title="Amminoacil-t-rna" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Amminoacil-t-rna" id="wx114">amminoacil-t-rna</a>. La conseguenza è che la traduzione potrebbe essere rallentata o addirittura interrotta. Per risolvere tale problema possiamo, come nel caso precedente, costruire una nuova versione compatibile del gene o coesprimere nell’ospite, in alte quantità su un plasmide a parte, il t-rna necessario alla traduzione.</p>

<p id="wx115">Tra gli altri problemi si riscontra la possibilità di trovare una f-met all’N-terminal, solitamente mantenuta in sistemi di espressioni procariotici. Tale amminoacido modificato potrebbe non essere ininfluente rispetto al folding e la funzione del prodotto finale. Per eliminare tale elemento possiamo procedere in due modi:</p>

<ol id="wx116">
<li id="wx117">
<p id="wx118">Inserire nel gene una sequenza per il targeting periplasmatico: in questo modo la proteina viene codificata e la coda all’N-terminale tagliata (insieme all f-met) una volta entrata nel periplasma.</p>
</li>

<li id="wx119">
<p id="wx120">Creare una sequenza N-terminale allungata contenente una coppia di PRO. Poi far esprimere all’ospite un enzima, noto come “<a href="/wit/Dipeptilammino_dipeptidasi_I" class="new" title="Dipeptilammino dipeptidasi I" wx:linktype="unknown" wx:pagename="Dipeptilammino_dipeptidasi_I" id="wx121">dipeptilammino dipeptidasi I</a>”, in grado di tagliare coppie di a.a. a partire proprio dall’N-terminale e di fermarsi solo dopo aver tagliato una coppia di PRO. In questo modo viene rimossa anche la f-met.</p>
</li>
</ol>

<p id="wx122">Alla fine dell’opera, qualunque tecnica si decida di seguire, è importante ricordare che la proteina finale deve avere:</p>

<ul id="wx123">
<li id="wx124">
<p id="wx125">stessa funzione</p>
</li>

<li id="wx126">
<p id="wx127">stessa sequenza primaria</p>
</li>

<li id="wx128">
<p id="wx129">stesso folding</p>
</li>

<li id="wx130">
<p id="wx131">stesse modificazioni post-traduzionali</p>
</li>
</ul>

<a id="Problemi_di_proteolisi" name="Problemi_di_proteolisi"/>
</wx:section></wx:section><wx:section level="2" title="Problemi di proteolisi" id="wxsec6"><h2 id="wx132">Problemi di <a href="/wit/Proteolisi" title="Proteolisi" wx:linktype="known" wx:pagename="Proteolisi" wx:page_id="1332318" id="wx133">proteolisi</a></h2>

<p id="wx134">Tutte le cellule contengono <a href="/wit/Proteasi" title="Proteasi" wx:linktype="known" wx:pagename="Proteasi" wx:page_id="334169" id="wx135">proteasi</a> endogene in grado di distruggere alcune strutture proteiche inutili alla sopravvivenza della cellula stessa. Generalmente le proteine attaccate da tali enzimi sono proteine incomplete, subunità in eccesso, proteine mal tradotte o degradate. Grazie all’ingengneria genetica però le cellule sono in grado di produrre alte quantità di proteine anche non endogene e che a conti fatti non servono a niente alla cellula che quindi decide di distruggerle. Questo per noi è un problema perché il nostro scopo è proprio quello di fargliele accumulare per poi purificarle e usarle a nostro scopo. Per risolvere questo problema possiamo:</p>

<ul id="wx136">
<li id="wx137">
<p id="wx138">usare ceppi proteasi deficienti</p>
</li>

<li id="wx139">
<p id="wx140">lavorare a basse temperature visto che le proteasi sono hot-stock</p>
</li>
</ul>

<a id="Proteine_di_fusione" name="Proteine_di_fusione"/>
</wx:section><wx:section level="2" title="Proteine di fusione" id="wxsec7"><h2 id="wx141">Proteine di fusione</h2>

<p id="wx142">E’ una tecnica che permette di creare due proteine differenti l’una attaccata all’altra. Ma perché dovremmo voler creare delle proteine di fusione?</p>

<ul id="wx143">
<li id="wx144">
<p id="wx145">per aumentare la solubilità della proteina eterologa</p>
</li>

<li id="wx146">
<p id="wx147">per poterle purificare in modo più efficace</p>
</li>

<li id="wx148">
<p id="wx149">perché possano essere secrete</p>
</li>
</ul>

<p id="wx150">Tra le due proteine viene solitamente inserita una sequenza che può essere riconosciuta da un enzima specifico in grado di tagliare tale sequenza e dividere le due proteine. Questa tecnica è estremamente efficace perché ci permette potenzialmente di purificare ogni genere di proteina mediante delle colonne per affinita.</p>

<a id="Targeting_periplasmatico" name="Targeting_periplasmatico"/>
</wx:section><wx:section level="2" title="Targeting periplasmatico" id="wxsec8"><h2 id="wx151">Targeting periplasmatico</h2>

<p id="wx152">Questo targeting proteico è estremamente utile perché:</p>

<ul id="wx153">
<li id="wx154">
<p id="wx155">l’ambiente periplasmatico è estremamente ossidante e quindi favorisce un corretto folding proteico</p>
</li>

<li id="wx156">
<p id="wx157">Permette di eliminare la f-met all’N-terminale</p>
</li>

<li id="wx158">
<p id="wx159">Le proteine contenute nel periplasma sono solo il 4% sul totale e quindi aumenta l’efficienza di purificazione</p>
</li>

<li id="wx160">
<p id="wx161">La proteolisi è limitata in tale ambiente.</p>
</li>
</ul>
</wx:section></wx:section></div>
<div id="wx_categorylinks">
<a href="/wit/index.php?title=Speciale:Categories&amp;article=Espressione_eterologa" title="Speciale:Categories" wx:linktype="known" wx:pagename="Speciale:Categories" id="wx162">Categoria</a>: <span dir="ltr" id="wx163"><a href="/wit/Categoria:Genetica" title="Categoria:Genetica" wx:linktype="known" wx:pagename="Categoria:Genetica" wx:page_id="34130" id="wx164">Genetica</a></span></div>
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</div>
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